МОЛЕКУЛЯРНО–ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КОМПЛЕКСА CULEX PIPIENS (DIPTERA: CULICIDAE)

Н.В. Храброва^*, А.К. Сибатаев^**, В.Н. Стегний^***

НИИ биологии и биофизики при Томском государственном университете, 634050, Россия;

e-mail: ^*hrabrova@yandex.ru, ^**anuar@res.tsu.ru, ^***stegniy@res.tsu.ru

Комары комплекса Culex pipiens (Diptera: Culicidae) представляют большой научный и практический интерес. Они являются активными кровососами людей и известны как переносчики возбудителей ряда опасных заболеваний человека (Виноградова, 1997).

Culex pipiens L., 1758 – северный обыкновенный комар, включает в себя две формы, или экотипа (pipiens и molestus), для которых характерно симпатрическое распространение, небольшие морфологические и значительные биологические отличия (Виноградова, 1997; Лопатин, 2000). Единственным достоверным морфологическим признаком, позволяющим идентифицировать pipiens и molestus, является величина сифонального индекса личинок (Виноградова, 1997).

Culex torrentium Martini, 1924 считается видом–двойником Culex pipiens; литературные сведения о нем фрагментарны, не определены и границы ареала (Service, 1968; Dahl, 1988). Морфологически C. torrentium и C. p. pipiens близки, распространение симпатричное. В биологическом отношении C. torrentium также похож на C. p. pipiens – неавтогенный, эвригамный и гетеродинамный комар (Dahl, 1988; Виноградова, 1997). По личинкам виды не различимы; определение ведется только по самцам; диагностическое значение имеют особенности строения гипопигия (Виноградова, 1997). Для облегчения идентификации представителей комплекса Culex pipiens (C. p. pipiens, C. p. molestus и C. torrentium) была предпринята попытка поиска молекулярно-генетических маркеров.

Скрининг 26 RAPD–праймеров показал, что для идентификации C. torrentium и C. p. pipiens можно использовать фрагмент ДНК, амплифицирующийся RAPD–праймером OPA–11 (5'–CAATCGCCGT–3'). В спектре фрагментов ДНК, ам-плифицированных праймером OPA–11, был выявлен специфичный фрагмент ДНК размером 680 п.н., идентифицирующий C. torrentium. Маркер не подвержены внутри– и межпопуляционной изменчивости, он представлен в спектрах RAPD–фрагментов у всех особей C. torrentium (выборки из 12 природных популяций Томской области и республики Казахстан), но отсутствует в спектрах амплифицированных фрагментов ДНК C. p. pipiens (3 выборки) и C. p. molestus (9 выборок), т.е. присутствие RAPD–маркера среди продуктов амплификации характеризует особей C. torrentium, а его отсутствие – особей C. p. pipiens и C. p. molestus.

Определение последовательности нуклеотидов мономорфного RAPD–фрагмента позволило подобрать специфичные SCAR–праймеры:

SCARcp3 (5'–ATTTGGATTGGACTTTCTATTTA–3'),

SCARcp4 (5'–TTGAATTTTGACATGACGGTTTTT–3').

Результатом использования SCAR–праймеров является амплификация одного специфичного фрагмента ДНК (SCAR–маркера).

В ходе SCAR–ПЦР с праймерами SCARcp3 и SCARcp4 у особей C. torrentium и гибридов между самками C. p. molestus и самцами C. torrentium амплифицируется фрагмент ДНК размером 474 п.н.; особи C. p. pipiens и C. p. molestus характеризуются отсутствием амплификации фрагмента ДНК соответствующего размера. Применение SCAR–праймеров позволяет усовершенствовать метод RAPD–идентификации C. torrentium, сделать его доступным широкому кругу исследователей, так как в случае использования SCAR–праймеров отпадает необходимость в анализе набора фрагментов ДНК разных размеров.

Также была изучена диагностическая ценность маркеров, предложенных другими авторами для идентификации C. p. molestus и C. torrentium (рестрикционный анализ участка митохондриального гена COI, анализ размеров ПЦР фрагментов ITS2 регионов рДНК) (Виноградова, Шайкевич, 2005), C. p. pipiens и C. torrentium (маркеры, основанные на последовательности второго интрона гена ACE2) (Smith, Fonseca, 2004).

Для амплификации ITS2 регионов рДНК использовали праймеры 5.8S (5'–TGTGAACTGCAGGACACATG–3') и 28S (5'–ATGCTTAAATTTAGGGGGTA–3') (Proft, Maier, Kampen, 1999). У C. torrentium амплифицируется фрагмент ДНК размером около 410 п.н.; у C. p. pipiens и C. p. molestus – около 460 п.н. В рДНК гибридных особей от скрещивания самок C. p. molestus и самцов C. torrentium представлены оба варианта (материнский и отцовский) ITS2 регионов.

Участок митохондриального гена COI, амплифицированный праймерами UEA9 (5'–GTAAACCTAACATTTTTTCCTCAACA–3') и UEA10 (5'–TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA–3') (Otranto, Traversa, Guida et al., 2003), подвергали воздействию рестриктазы SspI. Амплифицированный участок ДНК размером 311 п.н. после обработки рестриктазой SspI у C. torrentium оставался неизмененным, в то время как у C. p. pipiens и C. p. molestus он разрезался рестриктазой на два фрагмента размером 220 и 90 п.н. У гибридных особей от скрещивания самок C. p. molestus и самцов C. torrentium участок митохондриального гена COI расщепляется на два фрагмента так же, как у материнской формы. Было проведено секвенирование участка гена COI у особей C. p. pipiens и C. p. molestus. Сравнение нуклеотидных последовательностей показало, что они идентичны у особей C. p. pipiens и C. p. molestus.

В результате мультипраймерной ПЦР с использованием праймеров ACEpip (5'–GGAAACAACGACGTATGTACT–3'), ACEtorr (5'–TGCCTGTGCTACCAGTGATGTT–3') и B1246s (5'–TGGAGCCTCCTCTTCACGG–3') (Smith, Fonseca, 2004) у особей C. torrentium амплифицируется фрагмент второго интрона гена ACE2 размером 416 п.н., у особей C. p. pipiens и C. p. molestus – 610 п.н.; у гибридных особей от скрещивания самок C. p. molestus и самцов C. torrentium амплифицируются оба фрагмента. Секвенирование и сравнение нуклеотидных последовательностей участка второго интрона гена ACE2 у особей C. p. pipiens и C. p. molestus показало, что они идентичны между собой.

Выявлено соответствие результатов при использовании различных типов маркеров. Все изученные маркеры позволяют надежно идентифицировать особей C. torrentium на любой стадии развития организма. Известно, что личинки, куколки и самки C. torrentium и C. p. pipiens морфологически неразличимы; C. torrentium и C. p. pipiens различаются только по строению гениталий самцов, поэтому молекулярно- генетические маркеры для идентификации C. torrentium будут служить основой популяционно-генетических, эколого-фаунистических, фенологических исследований этого мало изученного вида. Например, до недавнего времени существовало единственное упоминание о встречаемости C. torrentium на территории Томской области: он был описан Шингаревым (1928) под именем C. pavlovsky. Однако, применение ДНК-маркеров позволило впервые показать, что в открытых личиночных биотопах Томской области доминантным видом является C. torrentium, а личинки C. p. pipiens встречаются с небольшой частотой (Храброва, 2006). Особи C. p. pipiens и C. p. molestus идентичны по всем изученным молекулярно-генетическим маркерам. Гибридных особей от скрещивания C. torrentium и C. p. molestus можно выявить как в ходе анализа размеров ПЦР–фрагментов ITS2 регионов, так и при использовании праймеров ACEpip, ACEtorr и B1246s.